Электронный журнал "Архитектура здоровья"
Категория: Технологии и информационные системы

Авторы: Н.Г. Туманова, М.В. Климушина, В.А. Метельская, С.А. Бойцов.

 

 

Резюме

Микрочиповая технология представляет собой удобный и относительно экономичный инструмент анализа специфичных биомаркеров с целью диагностики заболеваний, оценки эффективности терапии, исследования сигнальных путей. Для анализа белкового состава сыворотки крови нами были протестированы некоторые виды готовых микрочипов, ранее не применявшиеся на территории России. Нам удалось без предварительного обеднения сыворотки (удаления белков мажорных фракций) обнаружить 2% и 5% от матрицы чипов в зависимости от их разновидности. Таким образом, частичный белковый состав сыворотки крови можно анализировать с помощью микрочипов даже без предварительного удаления из нее белков мажорных фракций.

Ключевые слова: микрочипы; сыворотка крови; белковый состав.

 

Введение

Белковый микрочип представляет собой матрицу, содержащую молекулы белков или антител, предназначенную для одновременного анализа большого количества белковых компонентов в одном образце любой биологической жидкости. Микрочиповая технология является удобным и относительно экономичным по сравнению с тандемной масс-спектрометрией инструментом для анализа специфичных биомаркеров с целью диагностики заболеваний, оценки эффективности терапии, исследования сигнальных путей и пр.

Первые белковые микрочипы были разработаны еще в середине 80-х годов прошлого века, до разработки ДНК-микрочипов [1], но в силу длительности процесса их совершенствования они начали завоевывать область применения в лабораторной практике относительно недавно. По мере развития технологий, позволяющих улучшать качество специфичных антител против разнообразных белков, и снижения затрат на их очистку более совершенные микрочипы вышли на новую спираль развития и начали привлекать интерес исследователей в качестве инструмента для относительно экономичного единовременного анализа большого количества белковых маркеров в минимальных объемах сыворотки крови и других биологических сред [2, 3]. К настоящему времени разработаны платформы, содержащие до 9000 белков и более 4000 антител на одном слайде. Микрочипы, основанные на антителах, работают по принципу Western blot. Важно, чтобы выбранный продукт был надежен в эксплуатации и при соблюдении инструкции производителя гарантировал результат, адекватный заявленным характеристикам. Опыт показывает, что такое бывает не всегда. Стоимость микрочипов достаточно высока, чтобы перебирать продукты разных фирм-производителей вслепую и наугад, поэтому информация о том, насколько успешны были те или иные виды чипов для решения конкретных задач в реальной лабораторной практике, была бы полезной для исследователей и могла бы помочь сэкономить их силы, время и средства. На данный момент в российской печати практически отсутствуют сведения об анализе белкового состава биологических сред с использованием готовых микрочипов.

 

 

Прежде чем переходить к решению более тонких задач, связанных с поиском специфичных биомаркеров, мы протестировали некоторые виды чипов с целью определения наиболее подходящих для решения проблем, указанных выше. Для анализа белкового состава сыворотки нами были выбраны микрочипы SET 100 Full Moon Biosystems Signaling Explorer Antibody Microarray [4] (далее SET 100), AST 160 Full Moon Biosystems Signal Transduction Pathway Antibody Microarray (далее AST 160) (Full Moon Biosystems, США) и PlasmaScan™ 380 Antibody Microarrays (далее PS380) (Arrayit Corporation, США). Микрочипы SET 100 содержат 1358 уникальных антител, вовлеченных в 20 биологических сигнальных путей в двух репликах. Микрочипы AST 160 содержат 165 высокоспецифичных антител в шести репликах, характеризующих пути передачи сигнала. PS380 содержит 380 антител в шести копиях на слайде, что позволяет с помощью гибридизационной кассеты одновременно проанализировать 6 различных образцов на одном слайде. Известно, что данные виды чипов в нашей стране не применялись. Перечень белков, предназначенных для определения с помощью микрочипов, содержится в соответствующих GAL-файлах, которые доступны для скачивания на сайте компаний-производителей. Аббревиатура GAL образована начальными буквами исторически сложившегося названия списка компонентов GenePix Array List. Ныне эта аббревиатура укоренилась как термин и применяется для всех видов микрочипов.

 

 

Материалы и методы.

Обработка крови.

Кровь брали натощак из локтевой вены у нескольких добровольцев. Сыворотку крови получали методом центрифугирования крови при 1000g, 20 мин при 4°С. После отбора сыворотку центрифугировали при 10 000g, 15 мин при 4 °С, затем аликвотировали. Аликвоты хранили при -25 °С. В сыворотке измеряли концентрацию белка по методу Лоури [5], калибровку строили по человеческому сывороточному альбумину (ЧСА). Затем сыворотку разводили фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), готовым к употреблению (Arrayit, США) до конечной концентрации 100 мкг белка/100 мкл. Для этого сыворотку разводили сначала в 2 раза, затем, отобрав объем, содержащий 100 мкг белка, доводили объем PBS до 100 мкл.

 

 

Меченые белков сыворотки.

В микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл, помещенные в баню со льдом, вносили 100 мкл (100 мкг белка) разведенной PBS сыворотки (конечная концентрация 100 мкг/мкл). Затем в пробу вносили 20 мкл буфера для мечения белков, разведенного водой согласно инструкции производителя (Protein Labeling Buffer, Arrayit, США; H2O Arrayit, USA Protein Labeling Kit, Arrayit, США), и перемешивали на мешалке Vortex. После этого в пробы микрошприцем вносили 1 мкл краски (Arrayit Green 540, готовая к употреблению) и перемешивали на мешалке Vortex. Смесь инкубировали на ледяной бане в темноте в течение 1 ч. Молекулы флуоресцентного красителя ковалентно связываются с первичными аминами, обеспечивая прямое мечение белка. Молярное отношение красителя к белку составляет 40:1, т.е. 5-10 молекул краски на белок при мечении 100 мкг белка. Для остановки реакции мечения добавляли 10 мкл Stop Solution (Arrayit, США), перемешивали на Vortex и для инактивации молекул красителя инкубировали на льду 30 мин в темноте.

 

 

Гель-фильтрация для удаления несвязавшихся молекул флуоресцентной краски

Избыток молекул красителя удаляли методом гель-фильтрации. Подготовку колонок (Spin Columns, Arrayit Labeling Kit, Arrayit, США) проводили во время предшествующей часовой инкубации (на каждую пробу отводится по 2 колонки). В сухое содержимое колонок вносили по 650 мкл PBS, интенсивно перемешивали до полного растворения и образования геля. Затем гель перемешивали тонкой спицей для удаления пузырьков. Инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре с целью гидратации и активации гелеобразного матрикса. Затем колонки центрифугировали в течение 2 мин при 750g для удаления PBS. После этого на готовые к употреблению колонки наносили по 65 мкл полученной смеси меченых белков, что составляло половину от объема каждой пробы. Колонки устанавливали в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл для сбора меченых белков и центрифугировали при 750g 2 мин. Несвязавшаяся краска осталась в гелеобразном матриксе колонок. Выход белка после гель-фильтрации составил около 90%. Меченые белки хранили при -26°С.

 

 

Микрочипы

Выбранные нами микрочипы SET 100 и AST 160 (Full Moon Biosystems, США) и PS380 (Arrayit Corporation, США) представляют собой высококачественные стеклянные слайды размером 76*25* 1 мм, покрытые SD-полимером с ковалентно иммобилизованными антителами. Перечень антител содержится в прилагаемых к микрочипам GAL-файлах. Микрочипы SET 100 представляют собой платформу, содержащую 1385 антител в двух репликах на одном слайде, что позволяет анализировать один образец в параллелях для получения более точных результатов. Микрочипы AST 160 содержат 165 антител на один слайд, что позволяет анализировать один образец в шести параллелях (см.рисунок).

Микрочип PS380 позволяет одновременно анализировать шесть различных образцов с помощью гибридизационной кассеты.

 

 

В микрочипы включены положительные и отрицательные контроли. Положительные контроли представляют собой антитела, связанные с Су3, они предназначены для четкого позиционирования решетки GAL-файла при накладывании ее на пятна, полученные в результате сканирования микрочипа. Отрицательные контроли содержат бычий сывороточный альбумин. Они выглядят как пустые пятна и используются для учета фона при анализе изображения.

 

Подготовка и блокировка микрочипа.

Микрочип до извлечения из упаковки выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин. После извлечения из упаковки давали слайду просохнуть 15 мин. Затем слайд инкубировали в растворе Blocking Solution (30 мл) с 0,9 г сухого молока (Full Moon, США) в течение 40 мин на шейкере при комнатной температуре. Далее слайд десятикратно промывали деионизованной водой, поместив его в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл и интенсивно встряхивая в течение 10 с.

 

 

Гибридизация.

Слайд инкубировали в гибридизационной камере в течение 2 ч при комнатной температуре, перемешивая на шейкере в растворе Protein Coupling Mix, содержащем 6 мл Coupling Solution, 180 мкг сухого молока и 30 мкл меченого белка. Затем слайд дважды отмывали в 30 мл Wash Solution (Full Moon, США), перемешивая на шейкере при комнатной температуре в течение 10 мин. Далее микрочип десятикратно промывали деионизованной водой, как описано ранее. После этого слайд осушали центрифугированием на специальной центрифуге (Arrayit, США) и сканировали с помощью лазерного сканера для микрочипов (InnoScan® Microarray Scanner 900).

 

Сканирование микрочипов и анализ изображения

Микрочипы сканировали в ручном режиме при настройках: Scan Mode - normal, Speed = 20 l/s; Laser Power = 5,0 mW; PMT Gain = 100%; Pixel Size = 10 microns; Wavelengths = 532 nm.

После загрузки GAL-файлов и настройки решетки в ручном режиме с ориентацией по положительным контролям проводили анализ изображения с помощью программы Mapix V7.0.0, позволяющей получить до 25 разнообразных характеристик пятен, в том числе с вычетом фона, и идентифицировать пятна как белки согласно перечню, представленному в GAL-файлах.

 

Результаты и обсуждение

Для анализа белкового состава с помощью микрочипов SET 100 выбрали 7 образцов сыворотки добровольных доноров мужского и женского пола (4 мужчины и 3 женщины). В общей сложности в образцах удалось обнаружить 22 вида белков (табл. 1). Из них 9 видов присутствовали постоянно во всех анализируемых образцах (ЧСА, иммуноглобулины фракций G, М и А, фибронектин, киназа контрольной точки клеточного цикла, тирозиновая протеинкиназа Blk, тестостерон, херегулин), поскольку эти белки составляют значительную часть всего белкового состава сыворотки; остальные 13 видов белков присутствовали в тех или иных комбинациях.

Чтобы оценить воспроизводимость исследуемого полуколичественного метода определения белкового состава сыворотки с помощью SET 100, один и тот же образец сыворотки подвергали повторному анализу (табл. 2). При характеристике пятна мы ориентировались на показатель F532 Mean - В532, который представляет собой среднюю интенсивность пятна в пикселях с вычетом фона при длине волны 532 нм (зеленый сигнал лазера). Интенсивность пятен в пикселях нормализовали по ЧСА, разделив интенсивность полученных пятен на интенсивность пятна ЧСА. Полученные значения, отражающие относительное количество белка, выразили в относительных единицах (отн. ед.). Воспроизводимость по качественному составу анализируемых образцов сыворотки составила 100%: 15 из 15 обнаруженных белков были воспроизведены при повторном анализе. В среднем внутрисерийный и межсерийный коэффициенты вариации (CV%) составили 9,4 и 14,4% соответственно. Однако из табл. 2 видно, что есть некоторые белки, коэффициент вариации которых составляет более 30%. Мы полагаем, что такие выпадения следует рассматривать индивидуально и, возможно, исключать из анализа либо принимать решения относительно надежности измерения в каждом отдельном случае в зависимости от поставленных целей. При использовании данного метода с целью анализа биомаркеров, вероятно, не стоит рассматривать белки, определенные с высоким коэффициентом вариации, как надежную мишень.

Для трех из 15 белков (херегулин, eNOS, РКМ2) межсерийный CV% оказался >15%, для остальных белков - <15%, что является хорошим результатом для биологического теста.

Мы попытались увеличить количество видов белков, определяемых с помощью микрочипов SET 100, путем увеличения времени инкубации сыворотки крови с мечеными белками с 2 ч при комнатной температуре (как указано в инструкции производителя) до 16 ч (оставив образцы на ночь) при 4 °С (табл. 3).

В результате ночной инкубации к уже обнаруженным белкам прибавились еще несколько видов белков (GADD45beta, S100A10/P11, HSPB2), которые не были выявлены при стандартном времени инкубации. Однако в результате длительной инкубации некоторые пятна теряли четкость контура, поэтому мы не рекомендуем использовать столь продолжительную инкубацию как способ повышения качественного разнообразия белкового состава сыворотки.

Мы проанализировали белковый состав образцов сыворотки, определенный с помощью микрочипов SET 100, в зависимости от пола (табл. 4).

Во всех образцах сыворотки мужчин (п = 4) и женщин (n = 3) мы обнаружили 15 совпадающих видов белков. В то же время у мужчин обнаружили 7 видов белков, которых не было ни в одном образце сыворотки от женщин. Таким образом, у мужчин было обнаружено 22 вида белков, а у женщин - 15. Очевидно, что при поиске биомаркеров с помощью микрочипов необходимо соблюдать максимально одинаковые характеристики пациент/контроль, включая пол, чтобы обнаружить как можно более достоверные различия в белковом составе.

Результаты анализа белкового состава сыворотки крови с помощью микрочипов другого вида - AST 160 (Full Moon Biosystems, США) - приведены в табл. 5. Белки суммированы по результатам анализа трех образцов сыворотки от доноров-добровольцев мужского пола. Белок считали обнаруженным, если соответствующее ему пятно воспроизводилось в шести репликах (как отмечено выше, данные микрочипы содержат матрицу в шести репликах по каждому белку). Всего было обнаружено девять видов белков, из них четыре вида (IgA, IgM, al-антитрипсин, al-антихимотрипсин) - во всех трех образцах, остальные пять - факультативно. IgA и IgM, в отличие от остальных обнаруженных белков, были идентифицированы с помощью микрочипов обоих видов в силу того, что антитела против этих белков заложены в обоих видах чиповых матриц. Остальные виды белков в матрицах исследуемых микрочипов не пересекались.

В табл. 6 приведены количественные характеристики пятен, обнаруженных с помощью микрочипов AST 160. Видно, что чипы демонстрируют отличную внутрисерийную воспроизводимость. Средний CV% по микрочипам AST 160 составил 7,2%.

Наряду с экспериментами с использованием микрочипов SET 100 и AST 160 нами был проведен экспериментальный анализ белкового состава сыворотки крови с помощью микрочипов PS380 (Arrayit Corporation, США). С помощью данных микрочипов нам не удалось добиться результатов в силу того, что вместо пятен, которые должны быть окрашены в зеленый цвет на черном фоне, мы получили цветные пятна на белом фоне. Причины пока установить не удалось.

Таким образом, сравнивая результаты анализов белкового состава с помощью микрочипов SET 100 и AST 160, можно заключить следующее. Удалось без предварительного обеднения сыворотки (удаления мажорных фракций белков) обнаружить в случае SET 100 2% от матрицы чипа, в случае AST 160 - около 5% от матрицы чипа. Матрицы указанных микрочипов пересекались только по наличию IgM и IgA. Остальной белковый состав матрицы по выявленным белкам был уникален. Предварительное фракционирование сыворотки крови человека с помощью специальных коммерческих наборов Depletion kit, предназначенных для удаления мажорных сывороточных фракций, иммуноглобулинов и альбумина или еще большего количества видов мажорных белков, обеспечило бы повышение количества белка минорных фракций в объеме нанесения и таким образом могло бы способствовать повышению количества определяемых белков [6].

Таким образом, проведенный анализ белкового состава крови с помощью технологии микрочипов SET 100 и AST 160 позволяет анализировать частичный белковый состав сыворотки даже без предварительного удаления из сыворотки белков мажорных фракций.

 

Литература

1. Ekins R.P. and Chu F.W. Multianalyte microspot immunoassay -mi- croanalytical «compact disk» of the future. Clin. Chem. 1991; 37; 1955-67.
2. Zhu H., Bilgin M., Bangham R., Mall D., Casamavor A., Bertone P. Lan N., Jansen R. Global analysis of protein activities using pro- leome chips. Science. 2001; 293: 2101-5.
3. Wingren C. and Borrebaeck C. Antibody-based microarrays. Methods Mol Biol. 2009; 509: 57-84.
4. Cui W., Zhao S., Polanowska-Grabowska R., Wang J., Wei J., Dash B., Chang S., Saucerman J., Gu J.. Li M. Identification and characterization of poly(I:C)-induced molecular responses attenuated by nicotine in mouse macrophages. Mol. Pharmacol. 2013; 83(1): 61-72.
5. Lowry O.H., Rosbrough N.J., Farr A.L.. Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193: 265.
6. Luczak M, Marczak L., Stobiecki M. Optimization of plasma sample pretreatment for quantitative analysis using iTRAQ labeling and LC-MALDITOF/TOF. PLoS One. 2014; 9(7).

 

Источник: «Клиническая лабораторная диагностика», № 10 – 2015.

 

Чтобы оставить комментарий, Вам необходимо авторизоваться (либо зарегистрироваться)

Комментарии

  • Комментариев пока нет