Авторы: А.Р. Эльман, С.И. Рапопорт
Стабильно-изотопные дыхательные тесты
В экономически развитых странах диагностика заболеваний с использованием дыхательных тестов на базе изотопа углерода 13С существует уже более 15 лет. С момента одобрения FDA(FoodandDrugAdministration) и EMEA(EuropeanMedicinesAgency) в 1996 г. первого препарата для диагностики Helicobacterpylori – HP (уреазный дыхательный тест на основе 13С-мочевины) перечень разрешенных препаратов постоянно растет. В настоящее время только в США ежегодно проводится 5 – 7 млн. дыхательных тестов на сумму 800 млн. долларов, в Европе создаются новые производства тест-наборов вмасштабах до 3 млн. штук в год. Уреазный дыхательный тест (УДТ) признан золотым стандартом диагностики HP [1]
Принцип дыхательного теста
СИД основана на способности органов метаболизировать 13С-препараты с образованием 13СО2, который с током крови переносится в легкие и может быть обнаружен в выдыхаемом пациентом воздухе с помощью настольных приборов – масс-спектрометров или инфракрасных анализаторов. Диагноз ставят на основании превышения содержания выдыхаемого 13СО2 по сравнению с природным либо на основе анализа фармакокинетичеких зависимостей выдыхаемого 13СО2 во времени. Природное содержание изотопа углерода 13С в любых объектах составляет около 1,1%; при этом он не обладает радиоактивностью, как и обычный изотоп 12С. В теле человека содержится примерно 200 г изотопа 13С [2].
Принцип проведения 13С-дыхательного теста очень прост [3, 4]: пациент принимает 13С-препарат внутрь (в виде раствора либо в форме диагностического завтрака) из расчета 1 мг на 1 кг массы тела и через определенное время собирает выдыхаемый воздух в специальную емкость (вакутейнер или мешочек); затем с помощью указанного прибора анализируют нулевую пробу (до приема препарата) и пробы, собранные после приема препарата. Классическим примером стал тест на обсемененность желудка HP (УДТ), основанный на том, что фермент бактерии уреаза разлагает мочевину с образованием СО2 и после приема 13С-мочевины можно надежно определить изменение содержания изотопов 13С и 12С в выдыхаемом воздухе по формуле:
подставляя определяемые прибором величины изотопного отношения в образце [(13С/12С) обр.] выдыхаемого воздуха и в стандарте [(13С/12С) ст.]. Положительным считают результат, при котором Δ ≥ 4‰. УДТ весьма эффективен: его чувствительность и специфичность достигает 98—99% [5]. Кроме того, метод абсолютно безопасен в связи с неинвазивностью и отсутствием радиоактивных материалов.
В России СИД отсутствует, отсутствуют зарегистрированные высокообогащенные 13С -препараты (99% 13С)1 и приборы, а также утвержденные методики проведения дыхательных тестов. Проводятся лишь отдельные работы, в основном в исследовательских целях; при этом используются дорогие и труднодоступные импортные препараты и диагностическое оборудование2.
В то же время приказ Минздравсоцразвития России от 25.08.05 № 539 предусматривает повсеместное проведение диагностики населения с применением УДТ.
_______________________________________________________
1 Единственный зарегистрированный препарат «13С-Карбамид-тест» на основе 13С-мочевины с 30% изотопным обогащением [6] в силу ряда причин не может обеспечить массовой диагностики.
2 В основном применяются ИК-анализаторы (IRIS-2, UBiT IR-300, HeliFAN, POCone, The Oridion BreathIDR) [4] и масс-спектрометры (HeliView, IsoPrime), а также опттогальванический спектрофотометр LARA. Тест-наборы включают емкость с 13С-препаратом; пробирки, уплотненные мягкой пластиковой пробкой (или герметизируемые пакетики), и трубочку для выдыхаемого воздуха; инструкцию по применению препарата. Чувствительность современных изотопных масс-спектрометров позволяет определять 1000 молекул СО2 в пробе анализируемого газа [7], т. е. величину порядка 10—17% об. при анализе 1 мл газа (выдыхаемый воздух содержит около 0,04% об. 13СО2).
Отечественные разработки
Однако, ситуация резко изменилась в период с 2007 по 2012 г., когда при содействии правительства Москвы были разработаны технологии получения 30 13С-продуктов. В том числе 18 продуктов медицинского назначения, разработаны и изготовлены опытные образцы прибора для массовой 13С-диагностики методом дыхательных тестов, проведена медицинская апробация ряда методов диагностики, главным образом заболеваний органов ЖКТ.
Основные диагностические методики, разработанные в рамках данной программы:
УДТ на HP - основной по масштабам применения среди современных методов 13С-диагностики, т.к. считается, что HP вызывает многочисленные заболевания органов ЖКТ вплоть до рака желудка [9], а инфицированность населения в разных странах составляет от 50 до 80%. В Государственном научном центре РФ «Институт медико-биологических проблем РАН» разработан тест, позволяющий определить не только наличие или отсутствие активной HP (по пороговому значению δ), но и степень обсемененности ЖКТ в широких пределах (рис. 1, а).
Рисунок 1. Примеры отчечественных дыхательных тестов
Благодаря высокой чувствительности и на основе большого объема полученных данных авторы предлагают рассматривать 4 степени обсемененности (по значению Δ). При этом установлено, что максимальное значение Δ может достигать 80‰. Важными факторами являются состояние желудка и время отбора проб: оптимальным признан отбор проб воздуха на 15-й и 30-й минутах после приема препарата.
В результате совместных работ сформированы требования к тест-набору, разработана готовая форма препарата «Геликотест» на основе 99% 13С-мочевины (ГНЦ «НИОПИК»), проведено изучение общей и хронической токсичности (МНИОИ им. П.А. Герцена, РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН), выполнен проект производства субстанции и подготовлены документы для регистрации препарата. С учетом мирового опыта, а также при возобновлении всеобщей диспансеризации населения и согласно приказу Минздравсоцразвития России от 25.08.05 № 539 потребность России в препарате «Геликотест» может составить десятки миллионов тест-наборов в год (что эквивалентно 5 - 7 т/год 13С-мочевины).
Тест функциональной активности печени основан на метаболизме 13С-метацетина ее ферментными системами (CYP450) также с образованием 13СО2:
Тест позволяет с высокой точностью определить фармакокинетические параметры деметилирования метацетина и на этой основе оценить степень детоксикационной активности печени и даже ее массу, что чрезвычайно важно в послеоперационном периоде (после резекции). Разработанные математические модели позволяют различать степени цирроза, гепатита и других заболеваний (рис. 1, б) [11].
Исследования на базе ГКБ № 1 им. Н.Н. Пирогова позволили получить количественные характеристикивлияния ожирения печени на снижение ее детоксикационной активности. Результаты метацетинового теста при метастатическом поражении печени и в послеоперационном периоде позволяют с высокой точностью определить активность интактной ткани, а также наблюдать восстановление ее биохимических показателей. В ГНЦ РФ-ИМБП РАН показана возможность использования метацетинового теста для изучения функциональной активности печени в условиях застоя в венозной системе брюшной полости (венозное полнокровие), достигавшееся размещением пациента в так называемом антиортостатическом положении (под углом -15 градусов к линии горизонта) [12].
Метод позволяет изучать активацию желчевыделительной функции печени, а также определять ее полную (тотальную) метаболическую емкость, включая функционирующую и нефункционирующую (резервную) части печени [13].
Для диагностики перистальтики желудка изучен тест с использованием 1-13С-октаноата натрия и 1-13С-каприловой (октановой) кислоты (рис. 1, в), метаболизм которых также протекает с образованием 13СО2.
При нарушении перистальтики желудка скорость его опорожнения уменьшается; при этом замедляется и метаболизм указанных препаратов, что вызывает снижение содержания 13СО2 в выдыхаемом воздухе по сравнению с нормой. Установлено, что по методическим соображениям предпочтительнее использовать 1-13С-октаноат натрия.
Для диагностики функции поджелудочной железы по усвояемости жиров под действием панкреатической липазы (мальабсорбция) применяют дыхательный тест с использованием 13С3-триоктаноина (тройного эфира глицерина и 1-13С-каприловой кислоты).
Тест позволяет количественно оценить активность панкреатической липазы в тонкой кишке, уменьшение секреции которой наиболее характерно для проявлений хронического панкреатита [3]. В связи с наличием трех меток 13С в молекуле препарата тест обладает повышенной чувствительностью. Исследования показывают, что сопоставление результатов теста с данными триглицеридного теста (см. рис. 1, г), в котором используют т.н. смешанные триглицериды (тройные эфиры глицерина с радикалами 13С-меченной и немеченой кислоты), позволит различить процессы гидролиза белковой пищи в желудке и тонкой кишке.
Дыхательный тест с 13С-бикарбонатом натрия в настоящее время рассматривается как наиболее перспективная неинвазивная методика для определения кислотности желудочного сока, истинных энергозатрат организма при заболеваниях эндокринной системы, разных видах ожирения, а также для расчета калорийности питания, что является актуальным [14]. Проведение дыхательного теста на фоне блокаторов и стимуляторов желудочной секреции позволяет использовать его для дифференциальной диагностики причин, вызывающих изменения секреторной активности слизистой оболочки желудка, а использование на фоне проводимой терапии позволит контролировать эффективность последней и воздействие лекарственных средств наслизистую оболочку желудка. Кроме того, тест успешно применяется в пульмонологии для диагностики гиперкапнии [15].
Печеночный метаболизм
Впервые предложен дыхательный тест с 13С-формиатом натрия для дифференциальной диагностики работы ферментных систем CYP450 на разных стадиях печеночного метаболизма:
В сочетании с фармакокинетикой 13С-бикарбоната метод позволяет получить количественные значения показателей работы ферментных систем печени (константы скорости) на разных стадиях метаболизма.
При этом полученные показатели характерны для всех препаратов, имеющих изотопную метку в метильной группе, таких как 13С-метацетин, 13С2-антипирин, 13С2-эритромицин. Тесты показывают, что скорость биохимической реакции преобразования формиата в бикарбонат почти в 10 раз превышает все характерные скорости реакций в бикарбонатном пуле.
Дыхательные тесты с 13С-изотопомерами глюкозы, содержащими метку 13С в разных положениях молекулы глюкозы (и в разном количестве), позволяют диагностировать заболевания эндокринной системы, вызывающие нарушения углеводного обмена, например сахарный диабет.
Различия динамики образования 13СО2 в результате метаболизма 1-13С-глюкозы и 2-13С-глюкозы могут отражать, с одной стороны, неокислительный метаболизм (гликолиз), протекающий в цитозоле (в цикле NADP↔NADPH), а с другой - окислительный метаболизм в митохондриях (в цикле Кребса). Так, исследуя деятельность ферментных систем, можно диагностировать функциональное состояние органов ЖКТ, а также мышечной ткани и ЦНС.
При химиотерапии опухолей большое значение имеет правильный выбор дозы препарата [16]. Так, передозировка широко известного 5-фторурацила может дать сильный токсический эффект вследствие недостаточности ферментных систем, обеспечивающих метаболизм препарата. Безопасную дозу 5-фторурацила можно подобрать, используя дыхательный тест с микродозами (5 мг/кг) 2-13С-урацила, поскольку его метаболизм близок к метаболизму 5-фторурацила.
Другим примером использования 13С-препаратов в диагностике онкозаболеваний (с учетом также УДТ и 13С-метацетинового теста) является применение 13С-глюкозы и 5α-(13С)-тимидина. Эти препараты встраиваются в цепи ДНК и служат индикаторами пролиферации опухолевых клеток.
Необходимо отметить участие в работах по указанной тематике ведущих медицинских центров: ГНЦ РФ-ИМБП РАН, Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, НИИ СП им. Н.В. Склифосовского, ФМБА России, МКНЦ ЦНИИ гастроэнтерологии, МНИОИ им. П.А. Герцена, ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН, РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.
13С-магнито-резонансная диагностика
Успехи в развитии работ по СИД (13С), в том числе в области синтеза 13С-продуктов, открыли новые перспективы в изучении живых организмов, а также в диагностике опаснейших заболеваний, включая разные виды рака, болезнь Альцгеймера, болезнь Канавана, заболевания сердечно-сосудистой, эндокринной и других систем. Эти перспективы связаны с возможностью глубокого изучения метаболизма in vivo при разных заболеваниях с помощью 13С-биомаркеров методами, основанными на явлении 13С-ядерного магнитного резонанса (13С-ЯМР). Поскольку ядро изотопа 13С (как и ядро атома водорода - протон) имеет значение спинового числа 1/2, оно обладает магнитным моментом, и его сигнал регистрируется методом 13С-ЯМР.
Если ввести пациенту 13С-биомаркер эндогенной природы (меченый аналог вещества, участвующего в естественных процессах метаболизма, например 13С-глюкозу), изотопная метка вскоре перераспределится между другими метаболитами, и можно будет определить их концентрацию 13С-магниторезонансным методом. Важно то, что такое перераспределение может происходить достаточно быстро, например вследствие усиленного метаболизма в опухолях; при этом уровень метаболитов в пораженных органах и тканях существенно отличается от нормы. Метод обладает явными преимуществами, поскольку позволяет измерить уровень тех метаболитов, которые характерны для вполне определенного заболевания и которые весьма непросто определить другими методами (учитывая необходимость отбора биологических жидкостей и сложность биохимических систем живых организмов).
Как известно, состав и уровень метаболитов в здоровой и опухолевой клетках различны [17]. В мае 2012 г. журнал Science опубликовал данные о скорости процессов поглощения и выделения 111 метаболитов для 60 видов опухолей [18]. Анализ этого материала показал, каким видам опухолей соответствуют те или иные соотношения метаболитов. Появились даже так называемые карты метаболитов (или SIDMAP — Stable Isotope-based Dynamic Metabolic Profi ling). Например, скорость выделения аденозина клетками с меланомой (рак кожи и слизистых оболочек) на порядок выше, чем у клеток с лейкемией (рак крови), а для другого метаболита — орнитина — эта скорость в сотни раз больше, чем у аденозина, для всех видов опухолей. При раке легких в пораженных клетках в отличие от здоровых отмечаются очень высокие показатели концентрации молочной и янтарной кислот, а также глютаминовой и некоторых других аминокислот, тогда как концентрация глюкозы понижена [19]. Установлены «характеристические» значения уровней метаболитов для рака молочной железы, головного мозга, печени, толстой кишки, яичников, простаты, причем многие результаты получены именно с помощью 13С-ЯМР-спектроскопии.
В настоящее время конструируются датчики для обследования человека, например в форме подголовника для исследования головного мозга [20], изучаются режимы записи резонансных сигналов, разрабатываются методики введения 13С -препаратов как внутривенно, так и путем обычного приема внутрь в виде таблетки, раствора и т.п. Следует подчеркнуть, что для записи 13С-ЯМР-спектров используют обычные серийные томографы (рис. 2).
Уже опубликованы результаты клинического применения такой диагностики. Так, записывая 13С-ЯМР-сигналы 13С-креатина и 13С-холина после введения пациенту 13С-глюкозы, с помощью методов математической обработки удалось получить четкое изображение глиобластомы на обычной томограмме, где эта опухоль не видна [21]. Конечно, такие работы пока еще редкость: значительно больше исследований выполняется на животных — крысах, мышах, собаках [22].
Более 10 лет публикуются сведения об огромном увеличении чувствительности 13С магниторезонансной диагностики, если использовать так называемую процедуру гиперполяризации магнитных моментов ядер 13С. Отметим, что при этом значительно возрастает доля ядер 13С, реагирующих на магнитное поле томографа, что приводит к увеличению интенсивности сигнала в 10 000—100 000 раз! [23]. А в этом случае можно получать уже не только спектры (чтобы потом накладывать их на МРТ-снимки), а столь же качественные снимки внутренних органов, порой даже превосходящие по качеству обычные МРТ-снимки [24, 25]. Несмотря на то, что время сохранения гиперполяризованного состояния 13С-биомаркера относительно невелико (до нескольких минут в зависимости от строения), разработанные методики уже позволяют за это время получить десятки и сотни высококачественных МРТ-снимков. Кроме того, отсутствие радиоактивных веществ, дорогих и массивных синхротронов, а также жестких ограничений, связанных с быстрым распадом радиофармпрепаратов и потерей ими активности, делают этот метод значительно дешевле и безопаснее по сравнению с позитронно-эмиссионной томографией.
В отличие от многих стран, вынужденных импортировать изотопную продукцию, Россия имеет крупнейшее в мире производство стабильных изотопов. Это ключевое преимущество позволяет обеспечить отечественную медицину столь необходимыми 13С-препаратами, импорт которых весьма дорог. Все эти обстоятельства позволяют в кратчайшие сроки развить в России СИД (13С) для использования в самых разных областях медицины как с помощью дыхательных тестов, так и посредством визуализации внутренних органов, тканей и систем 13С-магниторезонансными методами. Освоение серийного выпуска 13С-препаратов и приборов и их широкое внедрение в медицинскую практику способно удовлетворить растущие потребности здравоохранения не только России, но и зарубежных стран.
Литература:
1. Current European concepts in the management of Helicobacter pylori infection. The Maastricht Consensus Report. Gut. 1997; 41:8 — 13.
2. Available at: http://www.textronica.com/basic/isotope_human.htm
3. Рапопорт С.И., Шубина Н.А., Семенова Н.В. 13С-Дыхательный тест в практике гастроэнтеролога. М.: ИД-МЕДПРАКТИКА-М; 2007.
4. Modak A.S. Stable isotope breath tests in clinical medicine: a review. J. Breath Res. 2007; 1: R1—13.
5. Gisbert J.P., Pajares J.M. Review article: 13C-urea breath test in the diagnosis of Helicobacter pylori infection — a critical review. Aliment. Pharmacol. Ther. 2004; 20: 1001—17.
6. КостинаГ. Спасительныйвыдох. Эксперт. 2008; № 29. Available at: http://expert.ru/expert/2008/29/spasitelnuy_vydoh
7. Available at: http://www.textronica.com/basic/ms_3.html
8. Кудрявцева Л.В., Щербаков П.Л., Иваников И.О., Говорун В.М. Helicobacter pylori-инфекция: современные аспекты диагностики и терапии (пособие для врачей). М.: 2004.
9. Available at: http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2005
10. Новрузбеков М.С., Донова Л.В., Ходарева Е.Н., Андросова М.В., Чжао А.В., Невмержицкий В.И. Прогностические критерии печеночной недостаточности после резекции печени при ее очаговом поражении. Анналы хирургической гепатологии. 2009; 14 (1): 41—8.
11. Афонин Б.В., Ермоленко А.Е., Иноземцев С.Л. Функциональное состояние печени при моделировании гемодинамических эффектов невесомости в организме человека. Физиология человека. 2012; 38 (4): 1-6.
12. Соловьева А.А., Афонин Б.В. 13С-Метацетиновый дыхательный тест в оценке функционального состояния печени при воздействии на организм факторов космического полета. В кн.: Материалы XV Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке». 27—29 ноября2013 г. Москва. М.; 2013.
13. Benzo R., Kurogi Y., Modak A. A non-invasive bicarbonate breath test (SBT) to rapidly evaluate arterial paCO2. Eur. Respir. J. 2004; 24 (48): 2081.
14. Modak A.S., Reid J.M., Williams L.A., Hobbs G.R. A simple noninvasive method to detect and monitor hypercapnia: the sodium [13С] bicarbonate breath test. Isotopes in Environ. Hlth Stud. 2007; 43 (1): 23—9.
15. Hirth J., Watkins P.B., Strawderman M., Schott A., Bruno R., Baker L.H. The effect of an individual’s cytochrome CYP3A4 activity on docetaxel clearance. Clin. Cancer Res. 2000; 6: 1255—8.
16. Boros L.G., Serkova N.J., Cascante M.S., Lee W.-N.P. Use of metabolic pathway fl ux information in targeted cancer drug design. Drug Discov. Today. 2004; 4: 435—43.
17. Jain M., Nilsson R., Sharma S., Madhusudhan N., Kitami T., Souza A.L. et al. Metabolite profi ling identifi es a key role for glycine in rapid cancer cell proliferation. Science. 2012; 336: 1040—4.
18. Fan T.W.M., Lane A.N., Higashi R.M., Farag1 M.A., Gao H., Bousamra M., Miller D.M. Altered regulation of metabolic pathways in human lung cancer discerned by 13C stable isotope-resolved metabolomics (SIRM). Mol. Cancer. 2009; 8: 1—19.
19. Ross B., Lin A., Harris K., Bhattacharya P., Schweinsburg B. Clinical experience with 13C MRS in vivo. NMR Biomed. 2003; 16: 358—69.
20. Sorensen A.G. Magnetic resonance as a cancer imaging biomarker. J.Clin. Oncol. 2006; 24: 3274—81.
21. Kurhanewicz J., Vigneron D.B., Brindle K., Chekmenev E.Y., Comment A., Cunningham C.H. et al. Analysis of cancer metabolism by imaging hyperpolarized nuclei: Prospects for translation to clinical research. Neoplasia. 2011; 13: 81—97.
22. Månsson S., Johansson E., Magnusson P., Chai C.-M., Hansson G., Petersson J.S., Ståhlberg F., Golman K. 13C Imaging — a new diagnostic platform. Eur. Radiol. 2006; 16: 57—67.
23. Golman K., Ardenkjær-Larsen J.H., Petersson J.S., Månsson S., Leunbach I. Molecular imaging with endogenous substances. Proc.Natl Acad. Sci. USA. 2003; 100: 10 435—9.
24. Ardenkjær-Larsen J.H., Fridlund B., Gram A., Hansson G., Hansson L., Lerche M.H. et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2003; 100: 10158—63.
Источник: журнал «Клиническая медицина», № 7, 2014