Авторы: Е.М. Пальцева, С.А. Осколкова, В.О.Полякова, Ю.С. Крылова, А.Г.Иванова, А.В. Абрамян, А.В. Гавриленко
Актуальность вопроса
Патологическая извитость (ПИ) внутренних сонных артерий – вторая по частоте причина развития симптомов сосудисто-мозговой недостаточности; уступает лишь атеросклеротическим поражениям магистральных артерий головы [1].
ПИ ВСА встречается у 5 – 7% взрослого населения [2].
Этиология окончательно не выявлена, большинство авторов считают, что извитость сонных артерий – результат врожденных [5, 6] или приобретенных факторов (АГ, атеросклероз, старение) [7, 9].
Наибольшее распространение получила классификация патологических форм ВСА J. Weibelи W. Fields[10, 11], которые выделяют3 типа деформации ВСА: извитость (tortuosity), петлеобразование (coiling) и перегиб артерий (kinking).
На сегодняшний день не существует единой теории возникновения данной патологии и остаются неизученными изменения структуры стенки артерии. Цель работы – исследование экспрессии эластина, коллагена Iи IIIтипов, матриксной металлопротеиназы 9 (ММП-9) и содержания гладкомышечных клеток в стенке ВСА при ПИ,возникающей на фоне фиброзно-мышечной дисплазии, с использованием иммуногистохимического (ИГХ) метода и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
Материал и методы
Исследованы образцы артерий 58 пациентов, проходивших хирургическое лечение по поводу ПИ ВСА. При морфологическом исследовании у 34 (59%) пациентов выявлено атеросклеротическое поражение сонных артерий, у 15 (26%) – фиброзно-мышечная дисплазия стенки артерии и у 9 (15%) – ее сочетание с атеросклерозом, т.е. ПИ ВСА наиболее часто развивалась на фоне атеросклеротического поражения артерий (p=0,03).
Для ИГХ-исследования отобран материал с фиброзно-мышечной дисплазией и сочетанным поражением, в образцах которого имелись достаточные для оценки результатов участки дисплазии (n=21, мужчин – 3, женщин – 18, средний возраст 56, 67 плюс-минус 10,61 года). Контрольная группа – 11 образцов внутренних грудных артерий (мужчин – 7, женщин – 4, средний возраст 59,27 плюс-минус 8,27 года), полученных при операции маммарокоронарного шунтирования. Для анализа результатов пациенты были поделены на группы в зависимости от возраста: молодой возраст – 25 – 44 года, средний-45 – 59 лет и пожилой возраст – 60 – 75 лет. По типам извитости материал был разделен следующим образом: с петлеобразованием (coiling) и перегибом (kinking) – по 4 (19%) образцам, с С-образной деформацией ВСА – 3 (14%) образца и с S-образной деформацией – 10 (48%).
Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине и после гистологической проводки заливали в парафин. Для гистологического исследования срезы толщиной 3 – 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, а также применяли комбинированную окраску фукселином и пикрофуксином.
Для ИГХ-исследования срезы толщиной 3 – 4 мкм монтировали на высокоадгезивные предметные стекла («GerhardMenzelGmbH»). Депарафирование и ИГХ-исследование проводилось по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max(«Leica»). Использовали первичные антитела к эластину (клон 10В8, «Abcam», разведение 1:400), коллагену Iтипа (клон 3G3, «Abcam», разведение 1:200), коллагену IIIтипа (клон Col-29, «Abcam», разведение 1:100) и гладкомышечному актину (SMA, клон 1А4, «Dako», разведение 1:400). В каждой серии препаратов использовали соответствующие положительные и отрицательные контроли. Срезы докрашивались гематоксилином. Препараты исследовали с помощью световой микроскопии. Результаты иммунопероксидазной реакции оценивали полуколичественным методом: (-) – отсутствие экспрессии, (+) – слабая, (++) – умеренная, (+++) – выраженная интенсивность иммуноперексидазной реакции. Для анализа данных типа эксрессии объединили в 2 группы: низкая (-, + для коллагена IIIтипа и +, ++ для остальных маркеров) и высокая (++ для коллагена IIIтипа и +++ для остальных маркеров) экспрессия. Для визуализации изображения использовали цифровую камеру «Leica».
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Исследование проводили на тонких депарафинизированных и дегидратированных срезах (2 – 4 мкм) с парафиновых блоков. Температурную демаскировку антигенов проводили с использованием 0,01 М цитратного буфера, pH6,0, под давлением. Для промывки использовался фосфатно-солевой буфер с твином-20. Срезы инкубировали 30 мин. с блокирующей сывороткой при комнатной температуре. После промывки наносили первые первичные антитела к ММП-9 (клон 439, «Novocastra», разведение 1:80) и инкубировали 1 ч. при комнатной температуре. В качестве вторичных антител использовали Alexafluor647, «Abcam». После дополнительной отмывки образцы инкубировали в течение 1ч. при комнатной температуре со вторыми первичными антителами к эластину (клон 10В8, «Abcam», разведение 1:400). В качестве вторичных антител использовали Alexafluor488, «Abcam». После отмывки срезы докрашивали DAPI, appliChem. Все образцы заключали в монтирующую среду DACO.Результат: первые антитела – красная флюоресценция; вторые антитела - зеленая флюоресценция; двойное окрашивание – голубая; контрастированное ядро – синяя. Исследование образцов проводили на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе OlympusFV1000D. Для изучения объектовполучали спектры флюоресценции и определяли количественные характеристики. Проводили измерение 2 параметров – относительную площадь экспрессии и площадь колокализации. Относительную площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Флюоресценцию с определенными спектральными характеристиками регистрировали только в плоскости (2D).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программного обеспечения SPSSStatistics17.0 forWindows. Достоверность различий между сравниваемыми группами (p) определяли с помощью критерия 
и точного метода Фишера. Для всех проведенных анализов различия считали достоверными при уровне значимости p
0,05.
Результаты и обсуждение
При гистологическом исследовании ВСА с фиброзно-мышечной дисплазией выявляли утолщенную интиму, нарушение структуры средней оболочки с фрагментацией эластических волокон, беспорядочным расположением коллагеновых волокон, формированием фиброзных разрастаний, местами отмечали деструкцию внутренней эластической мембраны.
При исследовании ИГХ-методом в контрольной группе у большинства пациентов (63,5%) отмечали низкую экспрессию эластина в медиальной оболочке артерий и лишь у 36,5% больных – высокую экспрессию (рис. 1, а). В то время как при ПИ ВСА содержание эластиновых волокон в медии было выше (у 81% — высокая экспрессия, у 19% — низкая; p=0,03), но выявляли их фрагментацию (см. таблицу, рис. 1, б).
Содержание коллагена I типа в средней оболочке стенки артерий было примерно одинаковым в обеих группах: в большинстве случаев отмечалась низкая экспрессия (90% при ПИ и 91% в контрольной группе; p>0,05) (см. рис. 1, в). Сопоставление экспрессии коллагена III типа также не показало достоверных различий между группами (р>0,05). У пациентов с ПИ в группе сравнения превалировала низкая экспрессия данного маркера — 90 и 73% соответственно (см. рис. 1, г). При этом в адвентиции содержание обоих типов коллагена было высоким как при ПИ, так и в контрольной группе.
Сравнение содержания гладкомышечных клеток выявило достоверные различия между группами (p=0,01): при ПИ ВСА низкую и высокую экспрессию гладкомышечного актина отмечали примерно в одинаковом количестве случаев (54 и 47% соответственно), в то время как в контрольной группе во всех образцах обнаружена его высокая экспрессия (100%) (см. рис. 1, д, е).
Поиск корреляций экспрессии каждого из четырех маркеров с полом и возрастом ни при ПИ ВСА, ни в контрольной группе зависимости не выявил (p>0,05). Ассоциации показателей экспрессии изучаемых маркеров с типом патологической извитости также не найдены (p>0,05).
Таким образом, выявлено, что при ПИ ВСА отмечается нарушение эластических свойств сосуда за счет разрушения эластических волокон, что согласуется с данными других авторов [14, 16]. При этом содержание коллагена I и III типов как в медиальной оболочке, так и в адвентиции остается неизменным. Уменьшение количества гладкомышечных клеток может приводить как к ухудшению механических свойств артерии, так и к нарушению синтеза ими компонентов внеклеточного матрикса. В работе G. La Barbera [15] также продемонстрировано уменьшение количества эластических волокон и гладкомышечных клеток.
При исследовании методом конфокальной микроскопии уровня экспрессии ММП-9, разрушающей эластин, и эластина в контрольной группе получены следующие значения: экспрессия ММП-9 составила 4,3±0,69; эластина — 16,2± 1,48 (рис. 2, а). В группе ПИ ВСА выявлена экспрессия ММП-9 26±1,26; эластина 9,1±0,36 (см. рис. 2, б). При сравнении экспрессии ММП-9 и эластина между группами выявлены достоверные различия (p<0,03 для ММП-9; p<0,05 для эластина). При этом отмечалась коэкспрессия данных маркеров в 16,9% случаях, т.е. в группе контроля наблюдался высокий уровень экспрессии эластина и низкий уровень экспрессии протеиназы, и, напротив, в группе ПИ — низкое содержание эластина и высокое — протеиназы. Таким образом, при ПИ ВСА происходит разрушение эластина матриксной ММП-9.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что одна из причин возникновения ПИ - нарушение эластических свойств сосуда за счет деструкции эластических волокон и их фрагментации, а также снижения количества гладкомышечных клеток и нарушения их синтетической функции, что обусловливает в свою очередь усиление активности ММП-9 и деградацию тканевого матрикса.
Литература:
1. Хорев Н.Г. Патологическая извитость внутренней сонной артерии и ее хирургическое лечение: Дис. ... д-ра мед. наук. Барнаул; 2000.
2. Illuminati G, Calio FG, Papaspyropoulos V, Montesano G, D’Urso A. Revascularization of the internal carotid artery for isolated, stenotic, and symptomatic kinking. Arch Surg. 2003; 138(2): 192-197. doi: 10.1001/archsurg.138.2.192.
3. Никоненко A.C., Губка A.B., Мастерухин A.H., Губка В.А. Оценка состояния церебральной гемодинамики у больных с патологической извитостью артерий, исходящих из дуги аорты, по данным ангиографии. Ышчна xipypem. 2000; 10: 5-7.
4. Бокерия Л.А., Суханов С.Г., Катков А.И., Пирцхалаишви- ли З.К. Хирургия патологической извитости брахиоцефальных артерий. Пермь: Курсив; 2006.
5. Смирнова Ю.В., Альмяшева Л.И. Этиология патологической деформации внутренних сонных артерий и патогенез нарушений мозгового кровообращения при этой аномалии (обзор литературы). Клиническая неврология. 2012;1:33-38.
6. Хаймович Г. Сосудистая хирургия по Хаимовичу. Под ред. Ашера Э. М: БИНОМ; 2010;т.2:181 -183.
7. Тимина И.Е., Бурцева Е.А., Лосик И.А. Современный подход к комплексному ультразвуковому исследованию больных с патологической деформацией внутренней сонной артерии. Ангиологияисосудистаяхирургия. 2011;3:49-57.
8. Aleksic М, Schiitz G, Gerth S, Mulch J. Surgical approach to kinking and coiling of the internal carotid artery. / Cardiovasc Surg. 2004;45(l):43-48.
9. Togay-l$ikay C, Kim J, Betterman K, Andrews C, Meads D, Tesh P, Tegeler C, Oztuna D. Carotid artery tortuosity, kinking, coiling: stroke risk factor, marker, or curiosity? Acta Neurol Belg. 2005; 105(2):68-72.
10. Weibel J, Fields WS. Tortuosity, coiling and kinking of the internal carotid artery. I. Etiology and radiographic anatomy. Neurology. 1965;15:7-18. doi: 10.1212/wnl.l5.1.7.
11. Weibel J, Fields WS. Tortuosity, coiling and kinking of the internal carotid artery. II. Relationship of morphological variation to cerebrovascular insufficiency. Neurology. 1965;15:462-468. doi:10.1212/wnl.l5.5.462.
12. Кузьмичева И.Н., Корчашкина Л.В., Москвина М.Ю. Цветовое дуплексное сканирование в диагностике патологической извитости внутренних сонных артерий. SonoAce-Ultrasound. 2011;22:48-52. Доступно по: http://www.medison. ru/si/art331 .htm. Ссылка активна на 15.06.2015.
13. Mumoli N, Cei М. Asymptomatic carotid kinking. Circ J. 2007;72:682-683. doi:10.1253/circj.72.682.
14. Кузык Ю.И. Патологические деформации сонных артерий: этиология, патогенез, клинические и патоморфологические изменения. Ангиологияисосудистаяхирургия. 2014;20(3): 123-128.
15. La Barbera G, La Marca G, Martino A, Lo Verde R, Valentino F, Lipari D, Peri G, Cappello F, Valentino B. Kinking, coiling, and tortuosity of extracranial internal carotid artery: is it the effect of a metaplasia? Surg Radiol Anat. 2006;28(6):573-580. doi: 10.1007/s00276-006-0149-1.
16. МинкинаC.M. Морфогенезфиброзно-мышечнойдисплазиипочечныхартерий: Дис.... канд. мед. наук. М.; 1981.
17. Ponticos М, Smith В. Extracellular matrix synthesis in vascular disease: hypertension, and atherosclerosis. J Biomed Res. 2014;28(l):25-39. doi: 10.7555/jbr.27.20130064.